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Canales voltaje-dependientes de Ca2+ tipo L
 

En las células en reposo, la concentración intracelular de Ca2+ ([Ca2+]i) es 20.000 veces menor que su concentración en el medio extracelular (<0.1 mM vs 1-2 mM) y el interior celular es electronegativo (-50 a -90 mV). Es decir, que existe un gradiente electroquímico que favorece la entrada de iones Ca2+ en la célula. Durante la activación celular, la [Ca2+]i aumenta hasta 0.3-1 mM como consecuencia de la entrada de Ca2+ desde el medio extracelular a través de la membrana, bien a través de canales voltaje dependientes tipo-L (y, en mucho menor grado, del intercambiador Na+-Ca2+) y/o de la liberación de Ca2+ desde sus depósitos intracelulares, principalmente el retículo sarcoplásmico (Ca2+ induced Ca2+ release).

La entrada de Ca2+ a través de los canales tipo-L de las células cardiacas genera una corriente de entrada de Ca2+ (ICa) que regula el acoplamiento excitación-contracción, la frecuencia de disparo del NSA, la velocidad de conducción a través del nódulo AV, la duración del potencial de acción cardíaco y ciertas formas de actividad focal arritmogénica (el automatismo anormal en fibras cardíacas isquémicas-despolarizadas y los pospotenciales tempranos generados en situaciones en las que se prolonga la duración del intervalo QT del ECG).

 

1. Estructura del canal

Los canales de Ca2+ voltaje-dependientes tipo-L son heterotetrámeros compuestos por 4 subunidades: una subunidad α1C que forma el poro del canal (1C o 1D, 242 kDa) y distintas subunidades auxiliares, incluídas el dímero α2/δ (175 kDa) unidas por un puente disulfuro y las subunidades β1-3 (55-60 kDa) intracelulares (Figura 1) (Nerbonne y Kass, 2005; Bodi y cols., 2005). Estas subunidades se codifican, respectivamente, por los genes CACNA1C o CACNA1D, CACNA2D1 o CACNA2D3 y CACNB1-3. Las subunidades β están estrechamente asociadas en la cara citoplásmica de la subunidad α1 (a través del lazo que une los dominios I-II), mientras que las subunidades α2δ están ancladas a la membrana plasmática e interactúan con dominios extracelulares de la subunidad α1.

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Figura 1. Topología de Ca2+ voltaje-dependiente tipo L

a. La subunidad α1C

(Cav1.2). Está formada por 2179 aminoácidos que se organizan en 4 dominios homólogos (DI-DIV), cada uno de los cuales está compuesto por 6 segmentos α-hélice transmembrana (S1-S6). (Figura 1) Esta subunidad contiene el poro iónico, que está formado por el lazo P que une S5 y S6 en cada dominio y penetra en la membrana, los filtros de selectividad, los mecanismos que regulan la cinética de apertura y cierre del canal y los puntos de unión para la subunidad β y para los bloqueantes de los canales de Ca2+ (IIIS5, III6 andIVS6). Al igual que el canal de Na+ voltaje-dependiente, se cree que la hélice del S4, que contiene varios residuos con cargas positivas, forma el sensor de voltaje, que se mueve en el campo transmembrana iniciando unos cambios conformacionales que modulan la conductancia del canal (Bezanilla, 2002, Caterall, 2000). La alta selectividad del canal para el Ca2+ con respecto a otros cationes monovalentes está relacionado con la presencia en cada uno de los lazos P de un residuo de ácido glutámico que forma una zona de alta afinidad (EEEE) por el Ca2+ (KD=500 nmol/L) análoga al locus DEKA de canales de Na+ y que conformaría el filtro de selectividad del canal (Koch y cols., 2000). La interacción entre α1 y la subunidad β citoplasmática se realiza entre una secuencia bien definida en la subunidad β (BID, dominio de interacción de subunidades) y el lazo intracitoplasmático (dominio de interacción o AID) que une los dominios DI y DII en la subunidad a1 (De Waard y cols., 1994; Pragnell y cols. 1994). Los sitios de posible interacción entre la subunidad α y el receptor de rianodina (RyR2) del retículo sarcoplásmico se localizan en el lazo que une los dominios DII y DIII.

El largo extremo C-terminal (1854-1921) es la diana de numerosas interacciones proteína-proteína. Contiene 5 serinas que facilitan su fosforilación por la PKA y la CAMKII, una mano EF (dominio estructural de proteínas de tipo hélice-bucle-hélice que se encuentra en una gran familia de proteínas de unión a Ca2+), sitios de unión para la calmodulina quinasa II (CaMKII) y la proteína fosfatasa 2A y un motivo de unión de calmodulina (CaM) Ca2+-dependiente formado por la secuencia isoleucina-glutámico (IQ), que está implicado en la autorregulación del canal (Zuhlke, et al., 1999; Bodi et al., 2005). La substitución de la isoleucina 1624 por una alanina previene la unión de la calmodulina y elimina la inactivación Ca2+-dependiente del canal (Zuhlke y cols., 1999). Tras su unión al Ca2+ la calmodulina sufre un cambio conformacional que promueve la inactivación Ca2-dependiente (Christel y Lee, 2012). Este es un importante mecanismo autoinhibitorio que impide la entrada excesiva de Ca2+. Al igual que la inactivación voltaje-dependiente que ocurre durante la despolarización, la inactivación Ca2-dependiente parece implicar reordenamientos conformacionales de la boca intracelular del canal.

La proteína de anclaje asociada a la proteína cinasa A (AKAP15) interactúa con el extremo C-terminal a través de un motivo que contiene leucina y que se une a la PKA cerca del sitio de fosforilación (serine1928) (Hulme JT 2003). La activación de los receptores β-adrenérgicos aumenta marcadamente la ICa y para ello se requiere su fosforilación por la PKA a través de la proteína de anclaje AKAP15 (α kinase anchoring protein). La disrupción del anclaje de la PKA a los canales Cav1.2 inhibe marcadamente su regulación a través de la vía de la PKA y la regulación β-adrenérgica de los mismos en los miocitos ventriculares. El extremo C-terminal se escinde de la subunidad α1 y puede formar un complejo con la subunidad truncada α1C a través de los dominios reguladores proximal y distal (PCRD y DCRD), actuando como un dominio de autoinhibición. La formación del complejo de autoinhibición reduce en gran medida la eficiencia de acoplamiento del sensor de voltaje y la apertura del canal y desplaza la dependencia de voltaje del proceso de activación a potenciales más positivos (Hulme JT 2006). El segmento N-terminal contiene un punto de fosforilación para la PKC y un punto de unión con la subunidad β (AID).

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b. Subunidades β

Se han identificado 4 subunidades β (β1-4, 55 kDa) codificadas por los genes CACNB1, CACNB2, CACNB3, and CACNB4, respectivamente. En general, la coexpresión de las subunidades β modula las propiedades biofísicas de las subunidades α1, produciendo un desplazamiento hacia la izquierda de la relación corriente-voltaje y regulan la expresión del canal en la superficie de la membrana celular.

La subunidad β2 parece ser la más prominente expresa en el corazón (Pérez-Reyes et al., 1992) y se une a través de una secuencia BID altamente conservada a la subunidad a1 a nivel del motivo BID (β subunits interaction domain) situados en el lazo intracitoplasmático que une los dominios DI y DII de la subunidad α1 (Pragnell y cols. 1994). Su función es regular la expresión de los canales tipo-L en la superficie de la membrana. La coexpresión de las subunidades β y α1C aumenta hasta 10 veces la amplitud de la ICa al incrementar la expresión del canal en la superficie del sarcolema y estabilizar el complejo α1-β a este nivel, aumentar la probabilidad de apertura del mismo, acelerar la cinética de activación/inactivación del canal, incrementar el número de sitios de unión de alta afinidad para las dihidropiridinas y, finalmente, regular la modulación del canal de Ca2+ inducido por la estimulación β-adrenérgica (Mikala et al, 1998, Yamaguchi et al, 1998; Wei et al, 2000). La subunidad β también antagoniza una señal de retención del retículo sarcoplásmico situada en el lazo DI-DII de la subunidades α1, facilitando el tráfico intracelular de subunidades α1C hacia la membrana plasmática y su correcta inserción a este nivel (Yamagichi et al., 1998; Bichet et al., 2000). La fosfatidilinositol-3-cinasa (PI3K) promueve la translocación de los canales de Ca2+ a la membrana, un efecto que requiere subunidades β2 (Viard et al., 2004).

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c. Las subunidades α2 y δ

La subunidad α2δ (143 kDa), codificada por los genes CACNA2D1, CACNA2D2, CACNA2D3 y CACNA2D4, se transcribe a partir de un único gen, traducido y procesado proteolíticamente en dos subunidades: α2 (N-terminal) y δ (C-terminal) que permanecen unidas por puentes disulfuro. La subunidad dominio α2 está localizada extracelularmente, mientras que la subunidad δ está compuesta por un único segmento transmembrana y por una pequeña porción intracelular. La coexpresión del complejo α2δ con la subunidad α1 duplica la expresión de los sitios de unión de las dihidropiridinas, las corrientes de gating y la amplitud de la ICa (Nerbonne y Kass, 2005), desplaza la dependencia de voltaje de la activación y acelera los procesos de activación e inactivación del canal (Bangalore et al, 1996;. Gurnett et al, 1996;. Singer et al, 1991; Varadi y cols., 1991; Hofmann y cols., 1994; Mori y cols. 1996). Se ha sugerido que el dominio δ produce los cambios cinéticos mientras que el domino α2 es responsable del aumento de la expresión del canal en la membrana (Nerbonne y Kass, 2005). Es posible que las subunidades α2/δ y β conduzcan la subunidad α1C a la membrana y permitan su adecuada localización a este nivel.

Figura 2: (A) ICa registrada en miocitos auriculares humanos tras la aplicación del protocolo que se muestra en la parte superior. Tomada de Van Wagoner y cols., 1999. (B) Cav1.2, β2 y α2/δ1 (Delpón y Tamargo. Nótese la diferencia de escala temporal entre los trazos de corriente de ambos paneles.

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2. Cinética del canal

Los canales tipo-L se activan-abren cuando se despolariza el potencial de membrana a valores positivos a -30 mV y la corriente alcanza su máxima amplitud entre 0 y +10 mV (Figura 2). El canal de Ca2+ presenta 3 estados conformacionales (Figura 3). Por tanto, se activan-abren durante la despolarización de la membrana y persisten abiertos durante toda la fase 2 del potencial de acción cardíaco, generando una corriente de entrada de Ca2+ o ICa. La activación y la inactivación son relativamente lentas, alcanzándose el pico máximo al cabo de 1-7 ms y se inactiva con una τinact > 500 ms.

La superposición de las curvas de activación e inactivación indica la existencia de una "ventana de ventana". Cuando el PA cardíaca se prolonga de forma excesiva (prolongación del intervalo QT) en potencial de membrana entra en un rango de potenciales (comprendido entre -15 y -40 mV) en el que la ICa que ha sido inactivada en gran parte durante la fase de meseta del PA puede ser parcialmente reactivada según la [Ca2+]i disminuye. Esta reactivación puede causar una despolarización neta del potencial de membrana e inducir pospotenciales tempranos y actividad desencadenada (triggered focal activity).

Figura 3. El canal de Ca2+ presenta 3 estados conformacionales. 

La inactivación del canal de Ca2+ es un proceso regulado por dos mecanismos: existe una inactivación dependiente de la [Ca2+]i y una inactivación dependiente de voltaje (Kass y Sanguinetti, 1984; Lee y cols., 1985). El inactivación Ca2+-dependiente es un proceso fisiológico que proporciona un mecanismo regulador que evitaría una sobrecarga de Ca2+ en los cardiomiocitos. La calmodulina parece jugar un papel central en este proceso. La calmodulina parece estar unida a la porción C-terminal de la subunidad α1C en reposo, cerca del motivo IQ y actúa como un sensor de α1C. Durante la despolarización el Ca2+ entra en las células y se une con una alta afinidad a los puntos de unión de la calmodulina, lo que reduce la inhibición que el motivo EF-mano ejerce sobre el lazo de unión entre los dominios DI-DII (la partícula bloqueante del canal); ello que permite su interacción con el poro y produce la inactivación del canal (Kim et al., 2004).

La recuperación de la inactivación es también un proceso voltaje y Ca2+ dependiente que se produce muy rápidamente cuando el potencial de membrana se repolariza casi por completo, aunque a cualquier nivel de potencial de membrana el proceso se retrasa si la [Ca2+]i permanece elevada. La combinación de una reducción lenta e incompleta de la [Ca2+]i durante la diástole y un acortamiento de los intervalos diastólicos, algo que a menudo se observa en pacientes con insuficiencia cardiaca o FA, disminuye la disponibilidad ICa.

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3. Regulación del canal

La densidad de canales de Ca2+ tipo L aumenta con la edad y en en diversas situaciones patológicas (hipertensión arterial, cardiomiopatías) y tras la ingesta de sal. Los fármacos que aumentan los niveles de AMPc (agonistas b-adrenérgicos, inhibidores de la fosfodiesterasa) activan la vía AMPc-PKA, que fosforila la subunidad α1C y aumentan la probabilidad de apertura de los canales tipo-L cardíacos y la ICa; la activación de la PKC por ésteres de forbol o angiotensina II también aumenta la ICa. Los fármacos que aumentan los niveles de GMPc (dadores de NO, acetilcolina) estimulan la PKG, que bloquea la ICa. Esta relación antagónica entre AMPc y GMPc permite al sistema nervioso vegetativo controlar la contractilidad y la frecuencia cardíacas. Los bloqueantes de los canales de Ca2+ inhiben de forma selectiva la ICa. La acidosis, la isquemia cardiaca y la fibrilación auricular disminuyen la ICa.

Los bloqueantes de los canales de Ca2+ se unen a puntos distintos de la subunidad α1C: las dihidropiridinas a los segmentos IIIS5 y IVS6 y éstas, así como verapamilo y diltiazem se unen  al segmento IVS6 (Hockerman et al., 1997; Bodi et al., 2005). Nueve aminoácidos localizados en los segmentos IIIS5 y  IIIS6 y en IVS6 contribuyen al punto de unión de las dihidropiridinas; una región de 4 aminoácidos (YMAI) en el motivo IVS6 constituye un punto de unión común para verapamilo y diltiazem. Todos los bloqueantes de los canales de Ca2+  se unen y estabilizan el canal en estado inactivo. Vepamilo y diltiazem presentan una alta afinidad  por los estados activo e inactivo del canal y prolongan su reactivación, por lo que el bloqueo del canal  de Ca2+ aumenta marcadamente a frecuencias cardiacas rápidas (bloqueo frecuencia-dependiente). Esta es la base de su utilización en el tratamiento de las taquiarritmias supraventriculares y en el cobntrol d ela frecuencia ventricular. Las dihidropiridinas no prolongan la reactivación, por lo que el bloqueo que producen no es frecuencia dependiente.

Mutaciones en la subunidad a están implicadas en el SQTL8, en el SBr3 y en el SQTC4, las mutaciones en el complejo β2δ en el SQTC6 y en el SRT y las que aparecen en la subunidad β2 en el SBr4 y en el SQTC5.

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4. Referencias

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